技巧大公开！藏得很深的主动脉夹层，还在纠结如何解离吗？
主动脉是人体内最大的动脉，主动脉夹层指主动脉腔内的血液从主动脉内膜撕裂处进入主动脉中膜，使中膜分离，沿主动脉长轴方向扩展形成主动脉壁的真假两腔分离状态。此种病态类型是一种严重威胁生命健康的危重症心血管疾病，严重时破裂将会危及生命。
但目前导致主动脉夹层的分子机制仍知之甚少，学术研究上常选用人正常主动脉壁和主动脉瘤夹层，或人工诱导小鼠产生主动脉瘤作为材料，进而深入研究主动脉夹层的发生机理和分子变化等，所以选取主动脉夹层这一组织进行研究具有重要的研究意义。
然而，人主动脉夹层临床样本难获取，样本十分珍贵，如果解离方法不合适，获得的活细胞数量少，活率低，将影响整体研究方案的顺利执行。
华大科技研发人员经探索新方法，现可以实现成功解离人主动脉夹层等疑难组织类型，助力加快此类型疾病的研究机理挖掘。
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解离前相关物料准备
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解离步骤
① 按照如下配方配制酶溶液：将CollagenaseⅠ、Collagenase Ⅱ溶于完全培养基中，至终浓度分别为600 U/ml，400 U/ml，置于37℃水浴锅中预热；
② 使用手术刀将保存在组织液中的组织块剪碎至1-2mm2大小，转移至含有酶溶液的50ml离心管中，于37℃水浴锅中消化1-2h；
③ 每30分钟吹打混匀，台盼蓝染色镜检，直至无明显组织块后停止消化；
④ 使用70μm细胞筛过滤细胞悬液（细胞筛需用预冷PBS提前润洗）。收集全部滤液至15mL离心管中；
⑤ 4℃离心，弃去上清；
⑥ 加入2ml常温红细胞裂解液，裂红2-5分钟，接着加入等量预冷PBS溶液终止裂红；
⑦ 4℃离心，弃去上清（若沉淀仍有明显红色，则再重复步骤5）；
⑧ 根据细胞沉淀量加入适量预冷完全培养基重悬并混匀沉淀；
⑨ 台盼蓝染色镜检观察细胞悬液中是否有较多死细胞和碎片，若细胞活率较差，则用美天旎试剂根据说明书进行去死细胞操作；
⑩ 加入适量培养基重悬细胞沉淀，计数。
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解离结果
图1 解离结果
a为组织剪碎后的结果图；b为细胞计数结果图
梳理完人主动脉夹层解离的技术步骤，科技君总结了四篇高质量的技术应用文章，与大家一同探索，助力研究！
案例研究1
单细胞转录组测序构建早期小鼠腹主动脉瘤血管细胞的异质性图谱
文章标题：Single-Cell RNA Sequencing Reveals Heterogeneity of Vascular Cells in Early Stage Murine Abdominal Aortic Aneurysm-Brief Report
发表时间：2021.03
发表期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology（8.311）
研究设计：对小鼠构建腹主动脉瘤（AAA）模型，使用假手术组（氯化钠）或氯化钙处理4天，分离AAA，进行单细胞RNA-Seq
DOI：10.1161/ATVBAHA.120.315607
案例研究2
单细胞转录组测序结合GWAS研究人主动脉瘤中的细胞动态和差异基因表达
文章标题：Single-Cell Transcriptome Analysis Reveals Dynamic Cell Populations and Differential Gene Expression Patterns in Control and Aneurysmal Human Aortic Tissue
发表时间：2020.10
发表期刊：Circulation（29.69）
研究设计：3名捐助者的正常主动脉壁组织及8名胸主动脉瘤（ATAA）患者的主动脉瘤组织，共分析48,128个细胞，进行单细胞RNA-Seq + GWAS
DOI：10.1161/CIRCULATIONAHA.120.046528
案例研究3
单细胞转录组测序揭示肾下腹主动脉瘤的细胞异质性
文章标题：Single-Cell RNA Sequencing Reveals the Cellular Heterogeneity of Aneurysmal Infrarenal Abdominal Aorta
发表时间：2020.07
发表期刊：Cardiovasc Res.（10.787）
研究设计：对小鼠构建AAA模型，通过假手术（热灭活弹性蛋白酶处理）或外膜周围弹性蛋白酶诱导AAA后第7天和第14天，分离小鼠的肾下腹主动脉瘤血管组织，进行单细胞RNA-Seq
DOI：10.1093/cvr/cvaa214
案例研究4
单细胞转录组测序揭示腹主动脉瘤的形成机理：巨噬细胞来源的netrin-1激活血管平滑肌细胞中的MMP3
文章标题：Macrophage-derived netrin-1 promotes abdominal aortic aneurysm formation by activating MMP3 in vascular smooth muscle cells
发表时间：2018.11
发表期刊：Nature communications（14.919）
研究设计：通过Ang II诱导和构建小鼠AAA模型，后分离AAA，进行单细胞RNA-Seq
DOI：10.1038/s41467-018-07495-1
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科技君点睛
高质量的单细胞悬液是单细胞测序成功的关键一环。由于各种组织类型胞间组成差异较大，制备悬液的方法也不尽相同，需要大量不同组织的解离经验加成，才能保证对各种组织解离起来得心应手。而华大科技在单细胞悬液制备上积累了多年经验，目前已完成人、鼠、家禽类和水产类等累计50+物种、300+种组织类型、5,000+份样本的成功解离，解离效果受到客户们的赞扬与支持。
悬液制备成功率与样本保存方式也有一定关系，优先推荐各位老师通过组织保存液寄送新鲜组织，可以较好地保留细胞活性。近期，科技君将着重介绍组织保存液保存新鲜组织的优势，敬请期待~
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